Op jacht naar vijandig DNA blijkt het systeem wel 100 verschillende stukjes DNA per seconde(!) te controleren.

Dat concluderen onderzoekers van de TU Delft nadat ze een CRISPR-systeem – terwijl het op vijandig DNA joeg – volgden. Hun bevindingen zijn terug te lezen in het blad Molecular Cell.

Wat is CRISPR ook alweer?
CRISPR staat voor Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats en maakt onderdeel uit van een bijzonder efficiënt verdedigingsmechanisme dat bacteriën inzetten in de strijd tegen piepkleine virusdeeltjes (ook wel bacteriofagen genoemd). Deze virusdeeltjes kunnen een bacterie letterlijk kapot maken. Dat doen ze als volgt: ze klampen zich vast aan de bacteriële cel en pompen hun DNA naar binnen, waarna ze de bacterie gebruiken om zichzelf duizenden keren te kopiëren. Zodra dat gelukt is, laten de virusdeeltjes de bacterie uiteenspatten en gaan de duizenden kopieën op zoek naar andere bacteriën waarin ze dat trucje nog eens kunnen herhalen. Gelukkig voor de bacterie is deze in dit hele scenario niet weerloos; hij beschikt over een verdedigingsmechanisme dat CRISPR-Cas wordt genoemd en uit twee onderdelen bestaat. Het ene deel jaagt op vijandelijk DNA en het andere knipt dat DNA kapot. Jaren geleden kwamen onderzoekers tot de briljante conclusie dat dit bacteriële verdedigingsmechanisme ook gebruikt kan worden om specifieke genen in levende cellen uit te schakelen. Of ‘foute’ stukjes DNA op te sporen, weg te knippen en te vervangen door een alternatief stukje DNA. Kortom: CRISPR-systemen bieden ons een relatief gemakkelijke, snelle en bijzonder precieze manier om DNA te bewerken. En niet alleen DNA van virussen, maar ook in planten, dieren en mensen. Naar verwachting kan CRISPR in de toekomst worden ingezet om genetische ziekten, maar bijvoorbeeld ook retrovirussen die zich in het DNA ophouden – denk aan HIV – te bestrijden.


Hoewel de mogelijkheden van de CRISPR-systemen eindeloos zijn en er al flink mee geëxperimenteerd wordt, zijn er ook nog veel vragen. Zo bleek bijvoorbeeld uit recent onderzoek dat het herschrijven van DNA met het bekendste CRISPR-systeem CRISPR-Cas9 weleens kan leiden tot ongewenste mutaties. En het zijn dat soort kwesties die toepassing ervan onder mensen voorlopig in de weg staan; pas als we de werking van de CRISPR-systemen doorgronden, kunnen we ze in gaan zetten om bijvoorbeeld genetische aandoeningen aan te pakken. Het nieuwe onderzoek dat nu aan de TU Delft is uitgevoerd, geeft meer inzicht in hoe CRISPR-systemen precies werken. De onderzoekers hebben namelijk voor het eerst een CRISPR-systeem aan het werk gezien in een levende bacterie waarin het systeem ook van nature voorkomt.

CRISPR-Cascade
Het onderzoek van de wetenschappers draait om het CRISPR-systeem dat ook wel CRISPR-Cascade-complex wordt genoemd. Het systeem onderscheidt zich op één punt heel duidelijk van het bekende CRISPR-Cas9-systeem, zo legt onderzoeker Jochem Vink aan Scientias.nl uit. “Cascade is een complex dat gevormd wordt uit meerdere eiwitten en op het moment dat Cascade zijn target (het aan te pakken stukje DNA, red.) gevonden heeft, rekruteert dit complex nog een ander eiwit (Cas3) erbij dat vervolgens het DNA vernietigt.” Het CRISPR-Cas9-systeem werkt net iets anders. “In het geval van Cas9 neemt een enkel eiwit zowel de herkenning als vernietiging van het DNA op zich.” Dat de onderzoekers ervoor kozen om het CRISPR-Cascade-complex te bestuderen en niet het bekende CRISPR-Cas9 heeft meerdere, goede redenen, zo vertelt Vink. “Ten eerste komen Cascade en soortgelijke complexen vele malen vaker voor in de natuur dan Cas9 en dat zou erop wijzen dat dit complex een belangrijkere rol speelt in de interactie tussen bacteriën en virussen. Ten tweede wilden wij voor het eerst kijken hoe het systeem werkt in zijn natuurlijke gastheer.” Dan is het handig om te kiezen voor een gastheer die reeds uitgebreid bestudeerd is, zoals de volledig uitgeplozen bacterie E. coli. “Deze heeft van nature wel Cascade-eiwitten, maar geen Cas9, dus hebben we voor Cascade in E. coli gekozen. Ten derde is Cascade het eerste CRISPR-systeem waarvan de werking – nog voor Cas9 bekend was – is bestudeerd.”

Lampje
De onderzoekers gingen dus aan de slag met E. coli-bacteriën, uitgerust met dat bacteriële verdedigingsmechanisme CRISPR-Cascade. Maar hoe volg je nu een eiwit op jacht naar vijandelijk DNA in een bacteriële cel? We vroegen het Vink. “Wij hebben een fluorescerend eiwit – eigenlijk een soort lampje dus – met Cascade (het eiwit dat op vijandelijk DNA jaagt) laten fuseren. Vervolgens hebben we het signaal van dat lampje gemeten in de microscoop en gekeken hoe Cascade zich verplaatste door de cel. Omdat we het signaal van een enkel complex volgen, is het signaal heel zwak en kun je het maar voor een paar frames volgen, voordat het lampje stuk is. Dus de data die we verkrijgen per Cascade-complex zijn eigenlijk grofweg 5 stapjes die het complex heeft gemaakt in de cel en omdat ze zo snel bewegen door diffusie (zie kader hieronder, red.) meten we elke 10 ms (honderdste van een seconde) waar het complex is. Als het complex aan DNA gebonden is, beweegt het niet, dus door te kijken naar de grootte van de stapjes en door data van duizenden complexen bij elkaar op te tellen kun je zien hoe vaak en hoelang Cascade gebonden is aan DNA en hoe vaak het verder beweegt op zoek naar de target.” Het onderzoek levert verbazingwekkende conclusies op. Zo blijken de Cascade-complexen razendsnel te werk te gaan en per seconde wel 100 stukjes DNA te controleren. “In eerste instantie verbaasde het ons hoe rap ze te werk gaan,” aldus Vink. “Maar aan de andere kant is het ook niet zo gek. Er is zoveel DNA om te checken en zo weinig tijd voordat een faag de cel heeft overgenomen dat de complexen wel snel móeten handelen.”


Diffusie
Om in korte tijd veel DNA te kunnen controleren, moeten de eiwitten die op jacht zijn naar vijandelijk DNA zich vrij snel door de bacteriële cel kunnen bewegen. “Dat gaat volledig automatisch, zonder energie te verbruiken, door middel van diffusie (ook wel brownian motion genoemd),” vertelt Vink. “Het gaat zelfs zo snel dat eiwitten in een seconde van de ene kant van de cel aan de andere kant zijn. En omdat Cascade ook voor al die scanning en bindingen ook geen energie nodig heeft is het een heel erg efficient proces.”

Implicaties
Het onderzoek levert verschillende nieuwe inzichten op, zo vertelt Vink. “Eerst vroegen we ons bijvoorbeeld nog af of het CRISPR-systeem op één of andere manier zijn eigen DNA omzeilt en voornamelijk aan de rand zou blijven wachten op binnendringende virussen. Dat blijkt niet zo te zijn, hij controleert echt ál het DNA in de cel ook dat van hemzelf. Dat verklaart ook waarom het systeem ook zo goed werkt in andere cellen, omdat het dus kan doordringen in die enorme brij van DNA.” Maar het feit dat het systeem al het DNA controleert, betekent dus ook automatisch dat het heel snel moet werken. “En dat zien we dus ook; het scant honderd DNA-plekken per seconde.” En eigenlijk is dat nog niet snel genoeg voor de bacterie. “Als je uitrekent hoelang het duurt om al het DNA te scannen, dan kom je op zo’n anderhalf uur. Dat is voor bacterieel DNA, het menselijk DNA is nog 1000x zo groot dus voor een complex zou het dan 1500 uur duren (ongeveer twee maanden). Gelukkig kan dit versneld worden door meerdere complexen in te zetten. We zijn er achter gekomen dat ongeveer twintig complexen per virus nodig zijn om een goede bescherming te geven voor een bacterie. In een menselijk cel, worden duizenden Cas9 complexen aan het werk gezet om te zoeken naar de target.”

Andere systemen
In de toekomst kan de methode die nu gebruikt is om het CRISPR-Cascade-systeem te volgen terwijl het actief is in een bacteriële cel, ook worden ingezet om andere CRISPR-systemen te bestuderen. “Daar verwachten we ook nog wel eventuele verschillen te zien, omdat sommige CRISPR-systemen niet DNA maar RNA aanvallen. Die zullen een cel dus waarschijnlijk heel anders scannen dan de DNA-systemen.”

Vink en collega’s zijn enkele van de vele onderzoekers die zich momenteel met de veelbelovende CRISPR-systemen bezighouden en ze continu, op verschillende manieren, onderzoeken en toetsen. In de hoop ze zo beter te gaan begrijpen en bovenal helder te krijgen of ze ook onder mensen veilig kunnen worden ingezet. Dat al die studies er uiteindelijk in uitmonden dat CRISPR-systemen linksom of rechtsom in menselijke cellen worden toegepast, lijkt puur als het gaat om de technologische kant van het verhaal bijna buiten kijf te staan. “De systemen worden steeds nauwkeuriger in zowel de herkenning als de aanpassing die ze vervolgens maken. Er zullen altijd risico zijn dat er een ongewenste mutatie ergens anders optreedt, want niks in de geneeskunde/biologie is 100% risicoloos, maar zeker in combinatie met goede monitoring en screening zullen deze risico’s op termijn veel kleiner worden dan risico’s die bepaalde andere medicijnen die we nu al gebruiken, hebben.” Veel spannender dan die technologische toets is misschien wel de ethische toets. “Willen we CRISPR inzetten om permanent menselijk DNA te veranderen?” vraagt Vink zich hardop af. Het is een vraag waar wetenschappers mee worstelen, maar die de toepassing van CRISPR op korte termijn niet in de weg hoeft te staan. “Ik denk dat een stap voorwaarts voor de korte termijn zal zijn dat we CRISPR-systemen gebruiken voor aanpassingen in cellen die niet permanent zijn en niet doorgegeven worden aan je kinderen. Een goed voorbeeld is een studie die nu wordt opgezet in China met patiënten met longkanker, daarvan kunnen ze de lichaamseigen immuuncellen die via een bloedprik zijn gewonnen herprogrammeren zodat ze de tumor aan kunnen vallen. Deze cellen hebben een beperkte levensduur dus een aantal weken later is er niks meer over van die modificaties en is de tumor hopelijk aangepakt.”